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Infecção por Escherichia coli uropatogênica

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Oct 21, 2023

Infecção por Escherichia coli uropatogênica

Nature Microbiology volume 8,

Nature Microbiology volume 8, páginas 875–888 (2023) Cite este artigo

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Infecções do trato urinário (ITUs) anteriores podem predispor a infecções futuras; no entanto, os mecanismos subjacentes que afetam a recorrência são pouco compreendidos. Anteriormente, descobrimos que as ITUs em camundongos causam remodelamento diferencial do epitélio da bexiga (urotelial), dependendo do resultado da doença, que afeta a suscetibilidade à ITU recorrente. Aqui, comparamos linhagens de células-tronco uroteliais (USC) isoladas de camundongos com histórico de infecção uropatogênica por Escherichia coli (UPEC) resolvida ou crônica, elucidando evidências de impressão molecular que envolveu alterações epigenéticas, incluindo diferenças na acessibilidade da cromatina, metilação do DNA e modificação de histonas . Marcas epigenéticas em USCs de camundongos cronicamente infectados aumentaram a morte celular mediada por caspase-1 após a infecção por UPEC, promovendo a eliminação bacteriana. O aumento da expressão de Ptgs2os2 também ocorreu, contribuindo potencialmente para a expressão sustentada da ciclooxigenase-2, inflamação da bexiga e feridas na mucosa - respostas associadas à cistite recorrente grave. Assim, a infecção por UPEC atua como um epimutagênico reprogramando o epigenoma urotelial, levando ao remodelamento intrínseco urotelial e treinando a resposta inata à infecção subsequente.

As infecções do trato urinário (ITUs) são uma das infecções bacterianas mais comuns em todo o mundo e são uma causa substancial de morbidade em mulheres saudáveis1,2. A alta taxa de recorrência em indivíduos suscetíveis torna o tratamento desafiador3, sendo um dos fatores de risco mais fortes para o desenvolvimento de ITU uma ITU prévia2. A base biológica para ITU recorrente (rUTI) é pouco compreendida.

Sem tratamento com antibióticos, as ITUs agudas em humanos se auto-resolvem ou se desenvolvem em infecções crônicas de longa duração4. A infecção de camundongos C3H/HeN com Escherichia coli uropatogênica (UPEC) recapitula esses dois resultados. A cistite crônica nesses camundongos é definida como bacteriúria persistente de alto título (bactérias na urina) acompanhada de inflamação crônica (camundongos sensibilizados), enquanto a resolução da infecção define camundongos resolvidos5. A análise das bexigas de camundongos resolvidos e sensibilizados revela que a infecção leva à remodelação diferencial da bexiga que afeta a suscetibilidade à rUTI. Camundongos resolvidos são resistentes a rUTI, em parte porque eles têm uma resposta acelerada e transitória de TNFα/ciclooxigenase-2 (Cox-2) na bexiga, que promove a rápida eliminação da infecção e cicatrização da mucosa6,7,8. Camundongos sensibilizados são altamente suscetíveis a rUTIs após o desafio, com expressão sustentada robusta de TNFα e Cox-2 na bexiga, causando transmigração de neutrófilos através do epitélio da bexiga (urotélio) e ferimentos na mucosa que promovem infecções bacterianas recorrentes graves6,7,8. Assim, dependendo da história da doença, o tecido da bexiga é diferencialmente remodelado de forma a aumentar ou diminuir a suscetibilidade a rUTI.

Esses fenótipos levaram à nossa hipótese de que a remodelação da mucosa da bexiga é mediada em parte por alterações epigenéticas nas células-tronco uroteliais (USCs) que afetam a defesa da mucosa da bexiga contra infecções subsequentes6,7. Assim, isolamos células epiteliais da bexiga de camundongos com diferentes históricos de doenças, estabelecemos linhas primárias de USC, as propagamos em cultura celular e formamos urotélio polarizado e totalmente diferenciado in vitro, que exibiu fenótipos morfológicos que se assemelhavam aos fenótipos de remodelação urotelial observados in vivo6 . Identificamos diferenças na acessibilidade da cromatina, metilação do DNA e modificações nas histonas nas linhas USC, que corresponderam a diferenças nas respostas transcricionais que afetam a morte celular programada e respostas inflamatórias reguladas pela ciclooxigenase-2 (Cox-2) que afetam a suscetibilidade à rUTI. No geral, nosso estudo fornece evidências epigenéticas de imunidade epitelial intrínseca causada por uma infecção bacteriana da mucosa, que altera a resposta da mucosa da bexiga a infecções subsequentes, dependendo do resultado original da doença. Esse achado pode explicar a alta prevalência de rUTI e ter importantes implicações terapêuticas para infecções bacterianas crônicas/recorrentes em geral.

4,000 ohm × cm2 were then analysed (5 transwells cultured from one juvenile C3H/HeN cell line). For consistency, TER was measured 1 d after media change. c,d, Differentiated urothelia on the transwells were fixed and imaged via (c) confocal microscopy and (d) SEM to show a top-down view of the urothelium at magnification 500× (top panel) and 10,000× (bottom panel). In c, samples were stained for F-actin, the terminal differentiation marker K20 and nuclei (DAPI). e–h, The urothelia were also paraffin-embedded, sectioned and stained with hematoxylin and eosin (H&E) (e) and immunostained for K20, Ecad and DAPI (f), Upk3a, p63 and DAPI (g) or K5, K14 and DAPI (h). Representative images are shown. Data are from 2–3 independent experiments using USCs from 5 different juvenile C3H/HeN mice./p>1.5, FDR < 0.05) were analysed using GREAT. Significance was determined using the binomial test. d,e, Differences in chromatin accessibility, DNA methylation and active histone modifications, H3K27Ac and H3K4Me3, in different USCs were assessed by ATAC-seq, whole genome bisulfite sequencing (WGBS) and CUT&RUN. d, Sensitized-specific DMRs (n = 189) among naïve, resolved and sensitized USCs are visualized as a series of heat maps displaying the epigenetic landscape overlapping each DMR for DNA methylation, ATAC and active histone modifications H3K27Ac and H3K4Me3. e, Average signals 5 kb upstream and 5 kb downstream of sensitized-specific hypo-DMRs (n = 183) for WGBS, ATAC, H3K27Ac and H3K4Me3 are visualized for each cell line. Average length of DMRs is 362 base pairs. DMRs are scaled for size with ‘start’ and ‘end’ of DMRs, which are indicated as grey bars. f, Sensitized-specific hypo-DMRs were annotated according to their predicted locations in the genome (n = 183). g, A PCA plot of all DMR comparisons showing clustering of the different cell lines. h, The top 15 enriched GO terms for sensitized hypo-DMRs were analysed using GREAT (n = 183)./p>0.5, Padj <0.05 are indicated as red dots. e, Pathway analysis was used to assess the biological pathways enriched in differentially expressed genes in mock-infected sensitized relative to resolved differentiated urothelia. Significance was determined using a right-tailed Fisher's exact test, with Padj < 0.05 being considered as significantly enriched pathways. Shown are selected pathways with z-score >2 and –log(P value) >4.2 from the specific enriched pathways by IPA. Pathways overlapping between mock-infected and UPEC-infected differentiated urothelia (Extended data Fig. 8d) are underlined. f, A heat map showing programmed cell death associated genes that are differentially expressed in mock-infected naïve, resolved and sensitized differentiated urothelia. Significance of DEGs was determined using Wald test, followed by multiple test correction using Benjamini-Hochberg FDR for adjusted P value./p>104 c.f.u. ml−1 urine) at every timepoint urine was collected (1, 3, 7, 10, 14, 21 and 28 d post-infection), while resolution of cystitis was defined as urine bacterial titre dropping below this cut-off in at least one timepoint./p>4,000 ohm × cm2), cultures were washed 3 times in warm DMEM/F12 media and infected with UPEC strains at multiplicity of infection 10. Transwells were then incubated at 37 °C for 30 min, changed to media containing 100 μg ml−1 gentamicin to clear the extracellular bacteria and cultured for an extended time. After infection, apical and basolateral media were spun down at 2,000 g at 4 °C for 5 min and used for LDH assay (TaKaRa, MK401). Transwells were washed with sterile PBS, then used for various analyses./p> 1.5) and resolved-specific DARs (FC < −1.5) were separately analysed and the top 15 enriched pathways are shown in Fig. 3e–f./p>

2 and –log(p-value) > 2 from the specific enriched pathways by IPA./p>

1.5, FDR < 0.05) used for GREAT GO term analysis. Tab 2 (Fig. 3d–h). List of 189 sensitized-specific differentially methylated regions (DMRs) from naïve vs sensitized and resolved vs sensitized comparisons./p>