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Mar 16, 2023

A fixação de metanol é o método de escolha para

Volume de Biologia da Comunicação

Biologia das Comunicações volume 6, Número do artigo: 522 (2023) Citar este artigo

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A principal etapa crítica na transcriptômica de célula única é a preparação da amostra. Vários métodos foram desenvolvidos para preservar as células após a dissociação para desacoplar o manuseio da amostra da preparação da biblioteca. No entanto, a adequação desses métodos depende dos tipos de células a serem processadas. Neste projeto, realizamos uma comparação sistemática de métodos de preservação para sequenciamento de RNA unicelular baseado em gotículas em células neurais e gliais derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas. Nossos resultados mostram que, embora o DMSO forneça a mais alta qualidade celular em termos de moléculas de RNA e genes detectados por célula, ele afeta fortemente a composição celular e induz a expressão de genes de estresse e apoptose. Em contraste, as amostras fixadas em metanol exibem uma composição celular semelhante às amostras frescas e fornecem uma boa qualidade celular e poucos vieses de expressão. Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que a fixação de metanol é o método de escolha para a realização de experimentos transcriptômicos de célula única baseados em gotículas em populações de células neurais.

Os métodos de transcriptômica de célula única (scRNA-seq) revolucionaram a maneira como estudamos de maneira de alto rendimento a expressão de genes em indivíduos, tecidos e até mesmo em doenças1,2,3. Anteriormente, os estudos se limitavam a identificar alterações nos níveis de expressão de genes em bulk, ou seja, na população de células que compunham uma determinada amostra. Assim, essas abordagens misturaram dois efeitos diferentes: mudanças na composição celular da amostra de interesse e mudanças na expressão de genes dentro de células individuais. Já o scRNA-seq permite avaliar esses dois efeitos de forma independente e pode detectar tanto alterações na composição celular4,5 quanto a expressão de genes em tipos celulares específicos6,7.

Apesar da popularidade dos métodos scRNA-seq, ainda existem vários desafios técnicos não resolvidos. Por exemplo, a dissociação das células de um tecido e a obtenção de uma boa suspensão celular, necessária para o scRNA-seq, é altamente específica do tecido e pode exigir o uso de diferentes estratégias, incluindo digestão enzimática, desagregação mecânica, célula ativada por fluorescência triagem e outras tecnologias8,9,10,11,12. Como resultado, a preparação de amostras para scRNA-seq pode levar várias horas, o que torna mais conveniente processá-las em momentos posteriores. Além das dificuldades técnicas, a preservação celular também é importante se precisarmos dissociar a dissociação e o processamento da amostra por outros motivos, como o envio de amostras para uma instalação externa, ou se quisermos coletar várias amostras e processá-las juntas em um momento posterior para economizar tempo ou dinheiro. Em todos esses casos, os pesquisadores gostariam de preservar essas amostras de forma a minimizar as diferenças na composição celular e na expressão gênica de células individuais em comparação com a amostra original. Ou seja, o melhor método de preservação será aquele que tiver o menor impacto na composição celular da amostra e no perfil transcriptômico das células individuais.

Vários métodos de preservação de células já foram desenvolvidos para superar esse problema e desacoplar o manuseio de amostras da preparação da biblioteca. Entre eles, encontramos soluções caseiras e comerciais, incluindo fixação de metanol13,14, propionato de ditio-bis succinimidilo15, criopreservação de dimetilsulfóxido (DMSO)16,17, metanol acético (ACME)10, paraformaldeído18, CellCover17 e vivoPHIX19. Esses métodos visam manter a composição da amostra e a qualidade do RNA das células. No entanto, considerando que a preparação da amostra é específica do tecido, esperamos que diferentes métodos de preservação possam ser ideais para diferentes amostras. Muitos desses protocolos foram testados apenas em linhagens celulares ou células de fácil obtenção, como células sanguíneas periféricas e, portanto, não está claro como é seu desempenho em células difíceis de dissociar ou potencialmente danificadas durante a dissociação. Em particular, nenhum dos métodos anteriores foi testado em neurônios maduros ou em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC), que são a principal fonte de células neurais para estudar os mecanismos moleculares que conduzem doenças neurológicas20.