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Mar 18, 2023

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Volume de comunicações da natureza

Nature Communications volume 14, Número do artigo: 2734 (2023) Citar este artigo

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Os tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) constituem um vasto e valioso banco de material do paciente para história clínica e dados de acompanhamento. Ainda é um desafio alcançar o perfil de RNA de célula/núcleo único (sc/snRNA) em tecidos FFPE. Aqui, desenvolvemos uma tecnologia de sequenciamento de snRNA baseada em gotículas (snRandom-seq) para tecidos FFPE, capturando RNAs totais de comprimento total com primers aleatórios. O snRandom-seq mostra uma taxa menor de doublet (0,3%), uma cobertura de RNA muito maior e detecta mais RNAs não codificantes e RNAs nascentes, em comparação com as tecnologias scRNA-seq de alto rendimento de última geração. O snRandom-seq detecta uma média de >3.000 genes por núcleo e identifica 25 tipos de células típicas. Além disso, aplicamos snRandom-seq em uma amostra clínica de câncer de fígado humano FFPE e revelamos uma subpopulação interessante de núcleos com alta atividade proliferativa. Nosso método fornece uma poderosa plataforma snRNA-seq para espécimes clínicos FFPE e promete enormes aplicações em pesquisa biomédica.

Os tecidos de rotina fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) são os espécimes arquiváveis ​​mais comuns, constituindo um vasto e valioso banco de material do paciente para história clínica, dados de acompanhamento, etc.1. A morfologia do tecido e os detalhes celulares dos tecidos FFPE são bem preservados para histopatologia pela reticulação de formaldeído entre DNA, RNA e proteínas. Inevitavelmente, as modificações irreversíveis causadas pela fixação de formalina em macromoléculas em amostras de FFPE sempre o tornam desafiador para aplicações em biologia molecular. Estudos recentes fizeram grandes progressos no perfil de transcrição em amostras de FFPE por métodos de extração de RNA otimizados2 ou perfilamento espacial in situ3. Nos últimos anos, os métodos de sequenciamento de RNA de célula única/núcleo de alto rendimento (scRNA/snRNA-seq) revolucionaram todo o campo da pesquisa biomédica4,5,6. Construímos o primeiro atlas de células humanas e de camundongos com nossas plataformas scRNA-seq personalizadas de alto rendimento7,8. Acredita-se que a caracterização precisa da transcriptômica de cada célula em espécimes clínicos de FFPE tenha a capacidade de fornecer uma melhor compreensão da heterogeneidade celular e da dinâmica populacional, melhorando assim a precisão do diagnóstico, tratamento e prognóstico de doenças humanas. No entanto, tanto o isolamento de células/núcleos únicos intactos quanto a captura de RNA de tecidos FFPE ainda são desafiadores devido à reticulação, modificação e degradação do RNA.

Atualmente, as plataformas sc/snRNA-seq de alto rendimento mais populares, como 10X Genomics Chromium Single Cell 3' Solution, dependem de oligo(dT) para capturar RNAs poli(A)+, de modo que principalmente o RNA mensageiro (mRNA) amadurecido ser detectados em vez de RNAs não poliadenilados para análise. Além disso, esses métodos sc/snRNA-seq baseados em oligo(dT) são principalmente restritos a amostras frescas ou congeladas, pois os primers oligo(dT) geralmente falham em RNAs degradados. Vários métodos foram desenvolvidos para superar esses desafios de diferentes perspectivas. SMART-seq-total9 e VASA-seq10 capturam transcritos poliadenilados e não poliadenilados implantando uma etapa extra de cauda de todas as moléculas de RNA com poli(A). Por outro lado, foi relatado que o SPLiT-seq11 foi usado com sucesso em células fixas usando primer aleatório que foi mais eficiente e mais amplo para capturar RNAs totais12,13. No entanto, esses métodos ainda não eram viáveis ​​para tecidos FFPE. Dois métodos publicados recentemente no bioRxiv, snPATHO-Seq14 e snFFPE-seq15, forneceram métodos otimizados para isolar núcleos únicos intactos de tecidos FFPE para realizar snRNA-Seq, o que demonstra a viabilidade de snRNA-Seq em tecidos FFPE e revela uma dimensão dessas amostras difíceis de usar. O snPATHO-Seq depende da tecnologia 10X Genomics baseada em sonda para que apenas genes limitados possam ser detectados14. O snFFPE-seq utiliza a plataforma 10X Genomics baseada em poli(A), que não é sensível o suficiente para capturar os RNAs de baixa qualidade dos tecidos FFPE15. Na prática, o perfil transcriptômico abrangente e em larga escala de espécimes clínicos é sempre necessário para identificar biomarcadores preditivos ou tipos de células raras. Portanto, o objetivo geral é ter uma abordagem que possa atender à necessidade de snRNA-seq de alto rendimento, alta sensibilidade e alta cobertura em tecidos FFPE.