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Sequenciamento paralelo de DNAs circulares extracromossômicos e transcriptomas em células cancerígenas únicas

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Jun 09, 2023

Sequenciamento paralelo de DNAs circulares extracromossômicos e transcriptomas em células cancerígenas únicas

Nature Genetics volume 55,

Nature Genetics volume 55, páginas 880–890 (2023) Cite este artigo

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DNAs extracromossômicos (ecDNAs) são comuns no câncer, mas muitas questões sobre sua origem, dinâmica estrutural e impacto na heterogeneidade intratumoral ainda não foram resolvidas. Aqui descrevemos DNA circular extracromossômico de célula única e sequenciamento de transcriptoma (scEC&T-seq), um método para sequenciamento paralelo de DNAs circulares e mRNA completo de células únicas. Aplicando scEC&T-seq a células cancerígenas, descrevemos diferenças intercelulares no conteúdo de ecDNA enquanto investigamos sua heterogeneidade estrutural e impacto transcricional. Os ecDNAs contendo oncogenes estavam clonalmente presentes em células cancerígenas e causaram diferenças na expressão de oncogenes intercelulares. Em contraste, outros pequenos DNAs circulares eram exclusivos de células individuais, indicando diferenças em sua seleção e propagação. Diferenças intercelulares na estrutura do ecDNA apontaram para a recombinação circular como um mecanismo de evolução do ecDNA. Esses resultados demonstram scEC&T-seq como uma abordagem para caracterizar sistematicamente o DNA circular pequeno e grande em células cancerígenas, o que facilitará a análise desses elementos de DNA no câncer e além.

Medir múltiplos parâmetros nas mesmas células é fundamental para entender com precisão os sistemas biológicos e suas mudanças durante doenças1. No caso de DNAs circulares, é fundamental integrar as informações da sequência de DNA com medições de saída transcricional para avaliar seu impacto funcional nas células. Pelo menos três tipos de DNAs circulares podem ser distinguidos em células humanas2,3,4,5: (1) pequenos DNAs circulares (<100 kb)6, que foram descritos sob diferentes nomes, incluindo eccDNAs6, microDNAs4, DNAs circulares apoptóticos6, pequenos DNAs circulares polidispersos7 e DNAs circulares teloméricos ou C-circles8; (2) círculos de excisão de receptores de células T (TRECs)9; e (3) grandes (>100 kb), oncogênicos, DNAs extracromossômicos circulares amplificados em número de cópias10,11 (referidos como ecDNA e visíveis como cromossomos minúsculos duplos durante a metáfase12). Apesar de nossa capacidade crescente de caracterizar vários recursos em células individuais13, uma caracterização aprofundada do conteúdo, estrutura e sequência do DNA circular em células individuais permanece indescritível com as abordagens atuais.

No câncer, as amplificações de oncogenes no ecDNA são de particular interesse, pois conduzem de forma potente a heterogeneidade do número de cópias intercelulares por meio de sua capacidade única de serem replicadas e segregadas de forma desigual durante a mitose14,15,16,17,18,19. Essa heterogeneidade permite que os tumores se adaptem e fujam das terapias2,20,21,22. De fato, pacientes com cânceres que abrigam ecDNA apresentam resultados clínicos adversos11. Investigações recentes indicam que ecDNAs contendo intensificador interagem uns com os outros em hubs nucleares17,23 e podem influenciar localizações cromossômicas distantes em trans23,24. Isso sugere que mesmo os ecDNAs que não abrigam oncogenes podem ser funcionais23,24. Além disso, revelamos recentemente que os tumores abrigam um repertório imprevisto de DNAs circulares menores e neutros em número de cópias de relevância funcional ainda desconhecida3.

Neste estudo, relatamos o sequenciamento circular extracromossômico de DNA e transcriptoma de célula única (scEC&T-seq), um método que permite o sequenciamento paralelo de todos os tipos de DNA circular, independentemente de seu tamanho, conteúdo e número de cópias, e mRNA completo em um único células. Demonstramos sua utilidade para o perfil de células cancerígenas únicas contendo ecDNAs multifragmentados estruturalmente complexos e pequenos DNAs circulares.

As abordagens atuais de purificação de DNA circular de última geração envolvem três etapas sequenciais, ou seja, isolamento de DNA seguido pela remoção de DNA linear por meio de digestão com exonuclease e enriquecimento de DNA circular por amplificação de círculo rolante3,6,25. Nós raciocinamos que esta abordagem pode ser reduzida para células únicas e quando combinada com Smart-seq2 (ref. 26) pode permitir o sequenciamento paralelo de DNA circular e mRNA. Para avaliar nosso método em células individuais, usamos linhagens celulares de câncer de neuroblastoma, que havíamos caracterizado anteriormente em populações em massa3. Usamos FACS para separar as células em placas de 96 poços (Fig. 1a, Suplementar Fig. 1a,b e Tabela Suplementar 1). O DNA foi separado do RNA poliadenilado, que foi capturado em grânulos magnéticos acoplados a sequências simples de primers desoxitimidina (Oligo dT), de forma semelhante às abordagens anteriores27. O DNA foi submetido à digestão com exonuclease, como realizado com sucesso em populações de células em massa no passado, para enriquecer o DNA3,6,25 circular (Fig. 1b). O DNA submetido à endonuclease PmeI antes da digestão com exonuclease serviu como controle negativo3. Em um subconjunto de casos, o DNA não foi digerido como um controle adicional (Fig. 1b). O DNA remanescente após os diferentes regimes de digestão foi amplificado. O DNA amplificado foi submetido ao sequenciamento Illumina paired-end e, em alguns casos, ao sequenciamento Nanopore de leitura longa (Fig. 1a). A composição da sequência de DNAs circulares foi analisada e a origem genômica foi inferida em regiões circularizadas usando algoritmos computacionais previamente estabelecidos para análise de DNA circular3.

100 kb) circular DNAs containing oncogenes, was observed after 1-day exonuclease digestion (P = 2.10 × 10−5, two-sided Welch's t-test; Supplementary Fig. 1e). This enrichment was not as pronounced as that of smaller circular DNAs after prolonged 5-day exonuclease digestion, suggesting that ecDNA may be less stable in the presence of exonuclease compared to smaller circular DNAs, or that small circular DNAs are more efficiently amplified by φ29 polymerase (Supplementary Fig. 1e,f). PmeI endonuclease incubation before 5-day exonuclease digestion significantly reduced reads mapping to mtDNA by 404.8 fold (P < 2.2 × 10−16, two-sided Welch's t-test; Fig. 1c,d and Supplementary Fig. 1c). Similar depletion was observed for reads mapping to circular DNAs containing PmeI recognition sites, confirming specific enrichment of circular DNA through our scEC&T-seq protocol (P < 2.2 × 10−16, two-sided Welch's t-test; Fig. 1f and Supplementary Fig. 1g,h). Significant concordance between Illumina- and Nanopore-based detection of circular DNAs suggested reproducible detection independent of sequencing technology (two-sided Pearson correlation, R = 0.95, P < 2.2 × 10−16; Supplementary Fig. 2a–d). Thus, scEC&T-seq enables the isolation and sequencing of circular DNAs from single cells./p>95%) circular DNAs detected in single cells were larger than apoptotic circular DNAs, suggesting that most circular DNAs were not a result of apoptosis, as suggested by other reports6 (Fig. 2a and Supplementary Fig. 4a). Thus, each cancer cell contains a wide spectrum of individual circular DNAs from different genomic contexts./p>69.5%). Because scEC&T-seq also detects mtDNA (Fig. 2c,d), we hypothesized that heteroplasmic mitochondrial mutations may enable lineage tracing, as demonstrated in other single-cell assays in the past32 (Fig. 1c,d and Supplementary Fig. 1c). Indeed, unsupervised hierarchical clustering by homoplasmic mtDNA variants accurately genotyped cells (Supplementary Fig. 10a). Heteroplasmic SNVs on mtDNA revealed high intercellular heterogeneity, and unsupervised hierarchical clustering on individual single cells grouped them, which indicates subclonality and may allow lineage tracing (Supplementary Fig. 10b and Supplementary Fig. 11a,b). Thus, scEC&T-seq can detect heteroplasmic variants in mtDNA and ecDNA, allowing for a wide range of SNV-based applications and analyses, including lineage inference./p> 30% and MAF < 0.1% for CHP-212 as well as MAF > 30% and MAF < 0.1% for TR14 were considered uninformative for clustering and removed based on spot checking./p>15% in single cells and >2.5% in nuclei) were also excluded. Data were normalized with a scale factor of 10.000 and scaled using default ScaleData settings. To account for gene length and total read count in each cell, the Smart-seq2 data were normalized using transcripts per million; then, a pseudocount of one was added and natural-log transformation was applied. The first four principal components were significant; therefore, the first five principal components were used for FindNeighbors and RunUMAP to capture as much variation as possible as recommended by the Seurat authors. The resolution for FindClusters was set to 0.5./p> 0.2 and supporting reads ≥ 50×). As for CHP-212 and TR14, a genome graph was built using gGnome61 (v.0.1) and manually curated. To check amplicon structure correctness for the patient samples, in silico-simulated Nanopore reads were sampled from the reconstructed amplicon using an adapted version of PBSIM2 (ref. 72) (https://github.com/madagiurgiu25/pbsim2) and preprocessed as the original patient samples. Lastly, the SV profiles between original samples and in silico simulation were compared. All reconstructed amplicons were visualized using gTrack (v.0.1.0; https://github.com/mskilab/gTrack), including the GRCh37/hg19 reference genome and GENCODE 19 track./p>