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Oct 26, 2023

Identificação do progenitor e SARS

Natureza volume 588, páginas

Nature volume 588, páginas 670–675 (2020) Citar este artigo

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O pulmão distal contém bronquíolos terminais e alvéolos que facilitam as trocas gasosas. Os sistemas tridimensionais in vitro de cultura pulmonar distal humana facilitariam fortemente a investigação de patologias como doença pulmonar intersticial, câncer e pneumonia por doença de coronavírus 2019 (COVID-19) causada pelo coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2). Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um sistema de cultura quimicamente definido, sem alimentador de longo prazo, para progenitores pulmonares distais como organoides derivados de células basais epiteliais alveolares humanas adultas únicas tipo II (AT2) ou KRT5 +. Os organoides AT2 foram capazes de se diferenciar em células AT1, e os organoides de células basais desenvolveram lúmens revestidos com células diferenciadas e ciliadas. A análise de célula única de células KRT5+ em organoides basais revelou uma população distinta de células mitóticas ITGA6+ITGB4+, cuja prole segregou ainda mais em uma subfração TNFRSF12Ahi que compreendia cerca de dez por cento das células basais KRT5+. Esta subpopulação formou aglomerados dentro de bronquíolos terminais e exibiu atividade de crescimento organoide clonogênica enriquecida. Criamos organoides pulmonares distais com polaridade apical-out para apresentar ACE2 na superfície externa exposta, facilitando a infecção de AT2 e culturas basais com SARS-CoV-2 e identificando club cells como população-alvo. Esta cultura de longo prazo e sem alimentador de organoides pulmonares distais humanos, juntamente com a análise de célula única, identifica a heterogeneidade funcional entre as células basais e estabelece um modelo organoide in vitro fácil de infecções pulmonares distais humanas, incluindo pneumonia associada a COVID-19.

O pulmão distal desempenha funções respiratórias essenciais que podem ser comprometidas por distúrbios inflamatórios, neoplásicos ou infecciosos, como a pneumonia por COVID-19. O estudo dessas condições seria facilitado por modelos in vitro robustos baseados em células humanas. As identidades das células-tronco que regeneram o epitélio pulmonar distal in vivo ao longo da vida humana foram inferidas a partir de estudos com camundongos, apesar das diferenças entre essas espécies1. Em humanos, as células-tronco basais abrangem toda a árvore das vias aéreas, enquanto em camundongos, células club2 e/ou células secretoras 1A1 (SCGB1A1) que expressam células não club3 renovam os bronquíolos distais durante o envelhecimento. Na região de troca gasosa, células epiteliais alveolares tipo II (AT2) de camundongos geram células AT1 e AT2 durante a homeostase4,5, e progenitores adicionais são recrutados em resposta a lesões graves3,6,7,8,9. A presença e/ou papéis de progenitores facultativos no pulmão humano são desconhecidos. As células AT2 humanas podem ser diferenciadas em células AT1, mas essas culturas têm vida curta e não demonstram autorrenovação de longo prazo ou permitem a expansão para modelagem de doenças4,10,11; além disso, seus requisitos para células alimentadoras impedem a definição de componentes de nicho específicos12,13. Estabelecemos uma cultura organoide de longo prazo do pulmão humano distal, incluindo AT2 e células-tronco basais, e usamos esse sistema para validar células progenitoras funcionais e modelar a infecção por SARS-CoV-2.

Definimos empiricamente condições médias para apoiar a expansão clonal de progenitores pulmonares distais humanos de 136 indivíduos na matriz extracelular de colágeno/laminina (MEC) (Fig. 1a, Tabela Suplementar 1). Juntos, o EGF e o antagonista de BMP NOGGIN sustentaram o crescimento de células pulmonares distais desagregadas ou de suas frações epiteliais purificadas (Dados Estendidos Fig. 1a–c). Células únicas (dados estendidos Fig. 1d–g) expandidas em organoides císticos SFTPC+HTII-280+ AT2 (Fig. 1b–e) ou organoides sólidos KRT5+ expressando o marcador de células basais KRT5 (Fig. 1b, f–h).

a. As culturas organoides D14 (dia 14) do pulmão distal humano contêm organoides císticos e sólidos. Inferior esquerdo, campo claro; direita, hematoxilina e eosina (H&E). Barra de escala, 100 μm. b, Imunofluorescência total com anticorpos anti-KRT5 (célula basal), anti-SFTPC (célula AT2) e anti-SCGB1A1 (club cell). Barra de escala, 100 μm. c–e, Organoides alveolares em D32. c, organoide AT2 cístico. ELE; barra de escala, 25 μm. d, Imunofluorescência total para anti-SFTPC, anti-HTII-280, faloidina (Ph) e DAPI; barra de escala, 50 μm. e, Anti-KI67 e fluorescência DAPI de uma seção adjacente a d. f–h, organoides basais em D32. f, H&E; barra de escala, 50 μm. g, Imunofluorescência total para anti-KRT5 e DAPI; barra de escala, 100 μm. h, imunocoloração Anti-KI67 e DAPI da seção adjacente a g. i–k, sequência de RNA de célula única de organoides pulmonares distais totais em D28. i, plotagem de incorporação estocástica vizinha t-distribuída (t-SNE) de 7.285 células individuais demonstrando populações AT2, basal e club. j, Expressão de SFTPC (AT2), KRT5 (basal) e SCGB1A1 (club). k, Gráficos de recursos para expressão de SFTPC (AT2), KRT5 (basal) e SCGB1A1 (club). l–p, cultura organoide AT2 clonogênica. l, microscopia de campo claro de organoides AT2 em D180; barra de escala, 200 μm. m, coloração H&E da cultura como em l; barra de escala, 50 μm. n, Microscopia eletrônica de transmissão do organoide AT2 em D32. LB, corpo lamelar; barra de escala, 5 μm. o, p, Imunofluorescência do organoide AT2 em D32 (o); cultura em vidro por 10 dias adicionais induz diferenciação em células AT1 (p). Imunofluorescência para anti-HTI-56 (AT1) e anti-HTII-280 (AT2); barra de escala, 50 μm. q, scRNA-seq apresenta gráficos de 2.780 células organoides AT2 em D89 de cultura cumulativa.