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Eosinófilos ativos regulam a defesa do hospedeiro e as respostas imunes na colite

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Eosinófilos ativos regulam a defesa do hospedeiro e as respostas imunes na colite

Natureza volume 615, páginas

Nature volume 615, páginas 151–157 (2023) Cite este artigo

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Na última década, a transcriptômica de célula única ajudou a descobrir novos tipos e estados de células e levou à construção de um compêndio celular de saúde e doença. Apesar desse progresso, algumas células difíceis de sequenciar permanecem ausentes dos atlas de tecidos. Eosinófilos - granulócitos indescritíveis que estão implicados em uma infinidade de patologias humanas1,2,3,4,5 - estão entre esses tipos de células desconhecidas. A heterogeneidade dos eosinófilos e os programas gênicos que sustentam suas funções pleiotrópicas permanecem pouco compreendidos. Aqui nós fornecemos um perfil transcriptômico de célula única abrangente de eosinófilos de camundongos. Identificamos uma população ativa e uma população basal de eosinófilos intestinais, que diferem em seu transcriptoma, proteoma de superfície e localização espacial. Por meio de uma triagem de inibição de CRISPR em todo o genoma e ensaios funcionais, revelamos um mecanismo pelo qual a interleucina-33 (IL-33) e o interferon-γ (IFNγ) induzem o acúmulo de eosinófilos ativos no cólon inflamado. Os eosinófilos ativos são dotados de atividade bactericida e reguladora de células T e expressam as moléculas coestimuladoras CD80 e PD-L1. Notavelmente, os eosinófilos ativos são enriquecidos na lâmina própria de uma pequena coorte de pacientes com doença inflamatória intestinal e estão intimamente associados às células T CD4+. Nossas descobertas fornecem informações sobre a biologia dos eosinófilos e destacam a contribuição crucial desse tipo de célula para a homeostase intestinal, regulação imunológica e defesa do hospedeiro. Além disso, estabelecemos uma estrutura para a caracterização de eosinófilos em doenças gastrointestinais humanas.

Os eosinófilos são granulócitos que residem principalmente no timo, útero, pulmão, tecido adiposo e trato gastrointestinal (GI)1. Seu acúmulo é típico de doenças como inflamação alérgica das vias aéreas, dermatite atópica, esofagite eosinofílica e doenças inflamatórias intestinais (DII)2,3,4,5. Os eosinófilos GI contribuem para vários processos homeostáticos, incluindo a preservação da barreira epitelial, o suporte da arquitetura do tecido, a manutenção das populações de células imunes e a regulação das respostas imunes locais6,7,8,9. No entanto, sua função durante a inflamação intestinal não é clara10. Além disso, a presença de subconjuntos de eosinófilos funcionalmente distintos e sua relação ontogenética permaneceram amplamente sem investigação devido a desafios técnicos que impedem seu interrogatório transcriptômico. De fato, os eosinófilos estão praticamente ausentes dos atlas11,12 de sequenciamento de RNA de célula única humana e de camundongos (scRNA-seq) e, portanto, representam um ponto cego em nossa compreensão das contribuições específicas do tipo de célula para a doença. Aqui, preenchemos essa lacuna no conhecimento resolvendo a heterogeneidade transcricional e funcional dos eosinófilos ao longo de sua trajetória de desenvolvimento desde a medula óssea (MO) até os tecidos de residência e definindo seu papel durante a inflamação intestinal.

Ao minimizar o estresse de cisalhamento, degranulação e consequente degradação do transcrito (Dados Estendidos Fig. 1a), obtivemos transcriptomas unicelulares de eosinófilos isolados da MO, sangue, baço, estômago, intestino delgado e cólon de camundongos Il5-tg, uma cepa que tem altas contagens de eosinófilos nos tecidos13 (Dados Estendidos Fig. 1b,c). Descobrimos que 89% de todas as células expressavam amplamente os marcadores de eosinófilos de boa-fé Siglecf, Il5ra, Ccr3 e Epx (dados estendidos, Fig. 1d). O agrupamento revelou cinco subpopulações ordenadas ao longo de uma trajetória de desenvolvimento (Fig. 1a,b). Precursores altamente cíclicos e eosinófilos imaturos estavam presentes principalmente na MO, e os eosinófilos circulantes estavam principalmente no sangue. Dois subconjuntos, denominados eosinófilos ativos (A-Eos) e eosinófilos basais (B-Eos), preencheram os tecidos GI em proporções variadas (Fig. 1c e Dados Estendidos Fig. 1e).

a, Aproximação e projeção uniforme do coletor (UMAP) de transcriptomas de eosinófilos obtidos de MO, sangue, baço, intestino delgado, estômago e cólon de camundongos Il5-tg (n = 3). b, Trajetória de diferenciação de eosinófilos. c, Distribuição de subconjuntos entre os órgãos (% de eosinófilos). d, Expressão de genes marcadores de cluster. Uma lista completa de marcadores de cluster está disponível na Tabela Suplementar 1. e, Top, UMAP de Cd80 e expressão de Cd274. Abaixo, níveis de expressão ao longo do pseudotempo. f, Topo, UMAP de perfis proteômicos de eosinófilos (citometria de fluxo espectral) isolados de sangue, baço, estômago, cólon e intestino delgado. Abaixo, mapa de calor da expressão mediana do marcador de superfície em subconjuntos (n = 5, B6J). g, Gráficos FACS representativos de A-Eos (PD-L1+CD80+) e eosinófilos PD-L1-CD80- nos órgãos. Os números indicam a porcentagem de eosinófilos. h, Imunofluorescência representativa de Siglec-F e CD80 no cólon de camundongo (n = 3, B6J). As setas marcam Siglec-F+CD80+ A-Eos (vermelho) e Siglec-F+CD80− B-Eos (verde). Núcleos corados com DAPI. Barra de escala, 20 µm. i, Intensidade média de fluorescência (MFI) de CD63, SSC-A e Siglec-F em A-Eos e B-Eos colônicos (n = 6, B6J). As medianas são mostradas. Teste t de Student bicaudal não pareado. j, Esquerda, imagens representativas de A-Eos e B-Eos intestinais citocentrados corados com anti-EPX e DAPI (n = 3, Il5-tg). Barra de escala, 10 µm. À direita, quantificação da intensidade da coloração EPX na periferia e no centro da célula. Os dados são a média ± dp Teste t de Student bicaudal não pareado. k, relação ativo-basal no terço luminal versus basal das criptas colônicas (n = 3, B6J). Teste t de Student pareado bicaudal. l, Esquerda, relação ativo-basal no terço luminal versus basal de criptas colônicas de núcleos de cólon humano saudável (n = 5). Teste t de Student pareado bicaudal. Direita, razão ativo-basal em amostras de amostras de indivíduos saudáveis ​​(5 indivíduos, 9 núcleos), pacientes com doença de Crohn (DC; 5 indivíduos, 9 núcleos) e pacientes com colite ulcerosa (CU; 4 indivíduos, 8 núcleos). ANOVA de uma via. Os dados são a média ± dp As informações do paciente são fornecidas na Tabela complementar 2. Em a,b,e,f, os pontos representam células individuais, coloridas pela identidade do cluster.

|2|) in BM-Eos treated with IL-33 and/or IFNγ (n = 4, B6J). All DEGs are listed in Supplementary Table 4. Bottom, expression of subset markers across conditions. Columns are clustered, rows are scaled. CPM, counts per million. b, Proliferation of anti-CD3/CD28-activated, CFSE-labelled naive CD4+ T cells co-cultured with BM-Eos conditioned with IL-33 and/or IFNγ (n = 4, B6J). Data are pooled from two independent experiments. Medians are shown. One-way ANOVA. c, A-Eos frequencies in mice treated with IL-33 and/or IFNγ (n = 5, B6J). Medians are shown. One-way ANOVA. d, A-Eos and B-Eos frequencies in DSS-treated B6J (n = 5) and Il33−/− (n = 4) mice. Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. e, Frequencies of IFNγ-, IL-17- and TNF-expressing colonic CD4+ T cells from mice in d. Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. f, Left, representative haematoxylin and eosin (H&E)-stained colonic sections of mice in d. Scale bar, 100 µm. Right, colitis score assessed by histopathological examination. Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. g, Representative molecular cartography images of human ulcerative colitis samples. Nuclei are stained with DAPI; CD4, SIGLEC8 and CD80 RNA molecules are shown in blue, red and yellow, respectively. Scale bar, 200 µm. h, Pairwise proximity score of transcripts across slides. The score indicates the fraction of slides in which the proximity of a pair of transcripts is significantly higher than expected by chance. P values are computed using a permutation test (Methods). Treg cells, regulatory T cells. i, Mean counts per slide of CD80 and NFKB1 transcripts in the proximity (<10 µm) of SIGLEC8 transcripts spatially associated with CD4 molecules versus SIGLEC8 molecules not associated with CD4 molecules. The central line in the box plot represents the median count per slide, the lower and upper hinge correspond to the first quartiles and the whisker extends from the hinge to the smallest or largest value no further than 1.5 times the interquartile range (IQR) from the hinge. Two-sided paired Wilcoxon test (17 regions of interest (ROIs), n = 4 patients)./p> 6). To quantify the co-expression of PD-L1 and MBP, the distance of each spot in the green channel to the nearest spot in the red channel was computed. Green spots (eosinophils) with distance to red spots < 4 µm were considered as active eosinophils (co-expressing PD-L1). Green spots with distance to red spots > 4 µm were considered basal eosinophils. The active-to-basal ratio was then computed by dividing the number of active by the number of basal eosinophils in each core. For localization analysis, the active-to-basal ratio in colon crypts of human and mouse tissue was calculated in manually drawn ROIs comprising the lower (basal) or upper (luminal) thirds./p> 0.5, P adjusted < 0.05) between A-Eos and tissue eosinophils. Non-parametric Wilcoxon rank sum test (FindMarkers function in Seurat). f, Representative FACS plots of PD-L1+CD80+and PD-L1−CD80− eosinophils in HDM- or PBS-treated mice (n = 2, B6J). Numbers indicate % of eosinophils. g, Left: Gating strategy used to identify resident (rEos) and inflammatory (iEos) eosinophils as described by17. Right: quantification of PD-L1+CD80+ and PD-L1−CD80− eosinophils in rEos and iEos. Medians are shown. h, MBP and PD-L1 immunofluorescence staining of human tissue microarrays. Representative cores from a healthy individual and a patient with Crohn's disease are shown (n = 5). Scale bars, 500 µm (core overview) and 10 µm (high magnification insets)./p> 0.5, adjusted P < 0.05) of circulating eosinophils found in the colon vs in the blood of C. rodentium-infected mice. Non-parametric Wilcoxon rank sum test (FindMarkers function in Seurat). g, Single-cell fate probabilities as calculated by CellRank and summarized for each cluster as a pie chart. Arrows represent velocity flow. Cells and pie charts coloured by cluster identity. h, Top: Workflow of in vitro conditioning. Bottom: A-Eos frequencies after conditioning with increasing doses of colon CM. Input: BM-derived (n = 5, B6J), blood (n = 5, Il5-tg) and splenic (n = 5, Il5-tg) eosinophils. Medians are shown. One-way ANOVA. i, Left: EYFP+ eosinophil frequencies over time across organs after single tamoxifen pulse in Id2CreERT2;RosaEYFP mice. Data represents mean ± SD. Right: Frequency of A-Eos and B-Eos in colonic EYFP+ eosinophils at day 2 and 4 post tamoxifen injection (n = 3, Id2CreERT2;RosaEYFP). Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. j, Antimicrobial and granulogenesis signature expression in A-Eos. k, Gene expression over common pseudotime at steady state (grey) and upon C. rodentium infection (dark red). Dots indicate single cells, coloured by organ: BM (blue), blood (yellow) and colon (red). l, Edu+/Edu− eosinophil ratio in the colon of C. rodentium-infected and control B6J (n = 5) and Il5-tg (n = 3) mice at day 4 post EdU injection. Data represent mean ± SEM. Two-tailed unpaired Student's t-test. m, Frequencies of eosinophil progenitors (gated as Live CD45+CD11b+IL5Ra+Lin-Sca1−CD34+) in C. rodentium-infected (n = 17) and control (n = 9) B6J mice. Medians are shown. Data pooled from two independent experiments. Two-tailed unpaired Student's t-test. n, MFI of CD63 in colonic A-Eos and B-Eos of C. rodentium-infected and control mice (n = 6, B6J). Medians are shown. Two-tailed unpaired Student's t-test. o, EPX immunofluorescence of sorted A-Eos of C. rodentium-infected and control mice (n = 5, Il5-tg). Nuclei are stained with DAPI. Insets show protrusions. Scale bar, 10 µm./p>