Oct 21, 2023
A ciclagem de triglicerídeos permite a modificação dos ácidos graxos armazenados
Metabolismo da Natureza volume 5,
Nature Metabolism volume 5, páginas 699–709 (2023) Cite este artigo
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A ciclagem de triglicerídeos é o processo de degradação contínua e ressíntese de triglicerídeos nos estoques celulares. Mostramos nos adipócitos 3T3-L1 que os triglicerídeos estão sujeitos a uma rápida renovação e rearranjo de ácidos graxos com uma meia-vida estimada de 2 a 4 horas. Desenvolvemos uma tecnologia de rastreamento que pode acompanhar simultaneamente e quantitativamente o metabolismo de vários ácidos graxos para estudar o ciclo de substrato fútil de triglicerídeos diretamente e com resolução de espécies moleculares. Nossa abordagem é baseada em traçadores de ácidos graxos alquinos e espectrometria de massa. A ciclagem dos triglicerídeos está ligada à modificação dos ácidos graxos liberados por alongamento e dessaturação. Por meio de ciclagem e modificação, os ácidos graxos saturados são lentamente convertidos em ácidos graxos monoinsaturados e o ácido linoléico em ácido araquidônico. Concluímos que a ciclagem de triglicerídeos torna os ácidos graxos armazenados acessíveis para alterações metabólicas. O processo geral facilita os ajustes celulares ao pool de ácidos graxos armazenados para atender às necessidades de mudança da célula.
A ciclagem de triglicerídeos/ácidos graxos (TG/FA) é o processo de degradação parcial ou completa da gordura armazenada para liberar AGs livres que subsequentemente são usados para ressintetizar uma nova molécula de TG. Por um lado, pode ocorrer em todo o corpo, onde os AG livres liberados do tecido adiposo podem ser reesterificados em TGs no fígado, levando à redistribuição no organismo da energia armazenada1. Por outro lado, também ocorre intracelularmente, como um típico ciclo de substrato 'fútil' que consome energia sem uma síntese líquida de material biológico2. A ciclagem de substrato intracelular em geral é um desafio científico tanto conceitual quanto experimentalmente. Do lado conceitual, a questão é se os efeitos benéficos dos ciclos de substrato podem compensar os custos energéticos ou se a ciclagem de substrato é uma imperfeição inevitável de redes complexas. As primeiras pesquisas sobre ciclagem de TG/FA enfatizavam seu papel regulatório, em particular na adaptação a mudanças rápidas no consumo de energia3,4, enquanto os custos energéticos do ciclo eram considerados pequenos5. Nos últimos anos, no entanto, um crescente interesse no ciclo originou-se da ideia de que ele pode contribuir substancialmente para a termogênese no tecido adiposo6,7. Uma melhor compreensão das vias termogênicas pode levar a novas estratégias para influenciar o gasto energético, possivelmente úteis na luta contra a pandemia global de obesidade8,9.
Limitações na tecnologia experimental são um grande obstáculo para uma melhor compreensão da ciclagem TG/FA. Ao usar a rotulagem isotópica convencional, a determinação precisa e direta da taxa e das vias de ciclagem é um desafio para o rastreamento metabólico, porque edutos e produtos podem se tornar indistinguíveis já após uma rodada de ciclagem (Fig. 1a). Portanto, os métodos existentes para estudar o ciclo TG/FA são bastante indiretos. Determinações raciométricas de incorporação de [3H]FA e [14C]glicose com determinação paralela da liberação de glicerol10 ou estratégias semelhantes com isótopos estáveis3 forneceram informações sobre o grau de esterificação e reesterificação de FA a partir do qual o ciclo pode ser deduzido pelo menos em termos relativos. Outros métodos usam rotulagem [2H]H2O ou [18O]H2O. O enriquecimento desses isótopos em TG forneceu informações sobre a síntese total e a renovação de TG11. No entanto, falta um experimento de rastreamento direto para mostrar que um pool 1 de TG celular definido daria origem a um novo pool 2 reutilizando os FAs do pool 1, conforme ilustrado na Fig. 1b. Isso exigiria um experimento de rotulagem com rastreamento multiparalelo abrangente de todas as possíveis moléculas TG marcadas, o que é um enorme desafio técnico. Recentemente, desenvolvemos uma tecnologia de rastreamento baseada em FAs marcados com alcinos com repórteres químicos de clique e espectrometria de massa (MS)12,13. Ele combina todas as características necessárias para o estudo da ciclagem de TG/AF: alta sensibilidade, especificidade inequívoca e, em particular, fácil discriminação de espécies lipídicas mono e multimarcadas12.
200 species. Over the chase period, we found a massive increase in single-labelled TG;Y1 species, in particular those containing long-chain FA;Ys (Fig. 4a), with a concomitant strong decrease of all three FA;Ys in double- and triple-labelled TG;Yn species (Fig. 4b,c). This behaviour can also directly be seen in the original spectra that visualize the alkyne-labelled neutral lipids by their neutral loss (NL) of 73.1 m/z (Extended Data Fig. 5). The kinetics of these decreases were different for double- and triple-labelled TG;Yn species. After 6 h, 46.7 ± 4.1% of the initial TG;Y2 was still present (Fig. 4b), in contrast to 36.5 ± 3.5% of the initial TG;Y3 (Fig. 4c). Regarding the decrease in TG;Y3, there was very little relative difference between the three input FA;Ys; regarding TG;Y2, the medium-chain FA;Y decreased slightly faster (residual amount after 6 h: FA 11:0;Y, 44.0%; FA 16:0;Y, 47.6%; FA 18:2;Y, 49.0%) than the two long-chain tracers. For all three FA;Ys together, the data were plotted as the fraction of total FA;Y that is found in TG;Y1, TG;Y2 and TG;Y3 (Fig. 4d). They demonstrate the re-distribution of FA;Y from triple- and double-labelled species towards single-labelled TG;Y1. TG cycling is the only consistent explanation for this observation. The most simple cycle would consist of TG hydrolysis yielding DG + FA and subsequent re-acylation to TG (Fig. 4e). The top row shows the situation after the 1-h labelling period. During the pulse labelling, the input FA;Ys (red) are a major fraction of the total FA that is used for TG synthesis, resulting in a large fraction of multi-labelled TG species. In numbers, the labelled TG;Yn pool contained 94 pmol of TG;Y3, 1,017 pmol of TG;Y2 and 3,030 pmol of TG;Y1 at the end of the pulse, provided as black numbers above the top symbols (Fig. 4e). Further, there is the unlabelled pool of endogenous TG of 138,000 ± 7,000 pmol, as obtained from lipidomics of unlabelled TG in the same samples. Following a theoretical binominal equilibration, the dilution of label can be calculated (blue numbers) for one complete TG → DG → TG cycle, predicting a 55% decrease of TG;Y2 and a 45% increase in TG;Y1, which is close to the situation at the 6-h chase time. Figure 4f shows an alternative way of representing the data. The lines represent the theoretical binominal distribution of total FA;Y over the three classes of TG;Yn, as a function of the fraction of FA;Y in the total FA of the TG pool. For each of the four experimental time points, we now determined the position of the data along the x axis that would best fit a binominal distribution. For the pulse alone, this results in a total fraction of FA;Y in total synthesized TG;Yn of 26%. This number indicates that during the labelling period, the labelled FA;Y contributed 26% of all FAs that were acylated to TG. In the absence of TG cycling, the relative amounts of the three labelled TG;Yn species would stay constant over time. However, the experimental data indicate that, with increasing chase time, the labelled FA;Y spreads from the small original pool to increasing pool sizes corresponding to 12%, 5% and 3.5% label content. This cycling-dilution process also explains why TG;Y3 disappeared faster than TG;Y2. Unless TG-degrading enzymes could sense the number of triple bonds in a TG species, for which there is no indication so far, both TG;Y2 and TG;Y3 would be degraded at the same rate. The apparent differences in the degradation kinetics are due to the different statistics of the re-acylation of DG;Y1 and DG;Y2 to TG;Y2 and TG;Y3, respectively. Quantitatively, these data indicated that the 6-h chase time corresponded to about 1.5 t1/2, suggesting a t1/2 of about 4 h. We next asked whether the observed cycling depends on a specific FA label combination and whether the alkyne label as such might be the cause of the cycling phenomenon (Fig. 4g–j). Therefore, we performed a pulse-chase experiment as described above, but with different FA combinations, that is, FA 11:0;Y/16:0;Y/18:2;Y (Fig. 4g) or FA 16:0;Y/18:2;Y/19:1;Y (Fig. 4i). The FA 19:1;Y has previously been used in hepatocytes12,13 and is a good analogue of oleic acid. The latter FA combination is a close mimic of the natural FA composition of the cells under study regarding chain length and double bond count (see Supplementary Table 1 for a detailed analysis of average C-atom and double bond numbers for the labelling experiments shown in Fig. 4g–j). Comparison of data from both FA combinations (Fig. 4g,i) shows that the cycling is independent of the presence of a medium-chain FA and takes place with very similar kinetics. Please note that these experiments have a higher kinetic time resolution and confirm the kinetics of the previous experiment. We also performed analogous pulse-chase experiments using isotope-labelled FA rather than alkyne-labelled FA. Combinations were FA 11:0[D3]/16:0[13C16]/18:2[13C18] (Fig. 4h) and FA 16:0[13C16]/18:2[13C18]/19:1[D8] (Fig. 4j). The analysis of isotope-labelled samples is demanding because isotope labelling lacks the superior analytical sensitivity and specificity hallmarking the alkyne tracers. As an illustration, Extended Data Figs. 6 and 7 show a comparison of primary spectra from the experiments in Fig. 4g,h. Alkyne-labelled TG species separate well from the bulk of unlabelled material (Extended Data Fig. 6a,b), and closer inspection indicates that the major labelled species are the same as the dominant endogenous species (see annotated spectrum in Supplementary Spectrum 1). In contrast, it is unavoidable that the isotope-labelled TGs become part of the crowded region of m/z 700–900 (Extended Data Fig. 7a). At least the peak of the dominant labelled TG 43:1 could be directly identified in the mixture, but the other species were not visually identifiable. An equivalent of the NL73 search for alkyne-labelled species does not exist for the isotope-labelled species, but the TGs that contained the labelled FA 11:0[D3] could be identified using an NL search for the loss of that FA together with ammonia, that is, at NL m/z 206.2. Such analysis was performed (Extended Data Fig. 7b) and yielded a reasonable spectrum. An equivalent LipidXplorer search algorithm was then used to identify and quantify the labelled TGs. Corresponding searches were also performed for the other isotope-labelled FAs. Although this is necessary to achieve the required specificity, it means that each group of isotope-labelled TGs is quantified by a different neutral loss, in contrast to the uniform quantification of the alkyne-labelled species, introducing a possible quantitative bias in the data. Finally, we could identify 105 isotope-labelled TG species (versus 270 alkyne-labelled TG species), just enough for calculations for single-, double- and triple-labelled TGs (Fig. 4h,j). These data showed that TG cycling takes place in the same way and with comparable kinetics for isotope- and alkyne-labelled species./p>
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