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Oct 14, 2023

Novo método estereológico para estimativa de contagens de células em andaimes de colágeno 3D

Relatórios Científicos volume 13,

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 7959 (2023) Citar este artigo

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Detalhes das métricas

Os métodos atuais para avaliar a proliferação celular em andaimes 3D dependem de mudanças na atividade metabólica ou no DNA total, no entanto, a quantificação direta do número de células em andaimes 3D continua sendo um desafio. Para resolver esse problema, desenvolvemos uma abordagem de estereologia imparcial que usa amostragem aleatória sistemática e seccionamento óptico de plano focal fino dos andaimes seguido pela estimativa do número total de células (StereoCount). Esta abordagem foi validada contra um método indireto para medir o DNA total (conteúdo de DNA); e a câmara de contagem de Bürker, o método de referência atual para quantificar o número de células. Avaliamos o número total de células para densidade de semeadura celular (células por unidade de volume) em quatro valores e comparamos os métodos em termos de precisão, facilidade de uso e demandas de tempo. A precisão do StereoCount superou significativamente o conteúdo de DNA para casos com ~ 10.000 e ~ 125.000 células/estrutura. Para casos com ~ 250.000 e ~ 375.000 células/scaffold, tanto o StereoCount quanto o conteúdo de DNA mostraram menor precisão do que o Bürker, mas não diferiram entre si. Em termos de facilidade de uso, houve uma grande vantagem para o StereoCount devido à saída em termos de números absolutos de células, juntamente com a possibilidade de uma visão geral da distribuição de células e uso futuro de automação para análise de alto rendimento. Juntos, o método StereoCount é uma abordagem eficiente para a quantificação direta de células em andaimes de colágeno 3D. Seu principal benefício é que o StereoCount automatizado pode acelerar a pesquisa usando andaimes 3D focados na descoberta de medicamentos para uma ampla variedade de doenças humanas.

A quantificação do número de células em um volume definido é uma métrica essencial para as comunidades mundiais de biocientistas e pesquisadores pré-clínicos. Em disciplinas envolvendo dispersão de células em volumes 3D, por exemplo, andaimes de colágeno 3D, são necessárias estimativas confiáveis ​​de células para o lançamento de experimentos, ou seja, semeadura de células e avaliação da morte celular e proliferação ao longo do tempo. A enumeração do número de células nesses casos é limitada a duas abordagens principais: A câmara de Bürker para contagens diretas de células a partir de suspensões celulares homogêneas (fase líquida); e abordagens baseadas em fluorescência para estimativa de DNA total, por exemplo, CyQuant®1,2. As desvantagens da abordagem de DNA total são a lise celular do pré-processamento da amostra, como a digestão do andaime pela colagenase e a necessidade de uma curva de calibração para cada experimento para garantir a leitura correta e as correlações entre a linearidade da intensidade do sinal e o número de células. Assim, não há método quantitativo direto para estimativa de contagens de células em andaimes 3D.

Para resolver esse problema, apresentamos StereoCount™, um novo método baseado em estereologia para quantificação direta de contagens absolutas de células em andaimes de colágeno 3D (Fig. 1).

Andaime de colágeno 3D semeado com células e usado para a quantificação de contagens de células.

Demonstramos a abordagem usando microscopia de fluorescência seguida por um corte óptico e análise de imagem, conforme detalhado em Materiais e métodos e na Fig. 2. Em segundo lugar, para evitar o viés introduzido pela contagem manual e melhorar o rendimento, introduzimos um fluxo de trabalho automatizado usando FIJI-ImageJ3 que usa dois scripts de macro e uma etapa intermediária baseada em aprendizado de máquina superficial (NL). Entre os benefícios estão o método que não requer digestão de andaime ou seccionamento de micrótomo e, como uma abordagem baseada em microscópio, fornece uma visão geral da distribuição celular no andaime como informação adicional. Aqui nós comparamos e contrastamos StereoCount com o método de conteúdo de DNA baseado na detecção de fluorescência do DNA total; e contagens de células usando o método de câmara de contagem (Bürker), um método geralmente confiável para quantificação de células.

Procedimento de amostragem StereoCount durante a microscopia. Os andaimes de colágeno tridimensionais (3D) são amostrados em 9 campos visuais XY e 30 Z-stacks. A contagem de células é determinada para cada coluna usando varredura óptica de plano focal fino (método do dissector óptico). A contagem de células das colunas é recalculada para todo o volume do andaime de colágeno.